Microdisección Láser

Servicio de Microdisección Láser Ibyme-Conicet

La microdisección láser es una tecnología que permite separar células únicas o pequeños grupos de células de manera selectiva, eficiente y rápida, a partir de cortes de tejido, extendidos celulares, o cultivos, permitiendo estudiar sistemáticamente la calidad y cantidad de ADN, ARN o proteínas en poblaciones específicas de células.

El IBYME cuenta con un laboratorio preparado para brindar este servicio tanto a investigadores internos como externos a la institución.

El sistema de microdisección por captura láser ArcturusXT es un moderno equipo que posee una combinación única de captura activada por láser infrarrojo y corte mediante láser ultravioleta, por lo que tiene una gran versatilidad y puede adaptarse a los requerimientos de muchas líneas de investigación.

El personal altamente capacitado del servicio brindará asesoramiento a los interesados para determinar la mejor estrategia a utilizar.

Microdisección Láser

Servicio de Microdisección Láser en el IBYME

El Instituto de Biología y Medicina experimental (IBYME) pone en funcionamiento un laboratorio especializado para brindar el servicio de microdisección por captura láser. Esta tecnología permite separar células únicas o pequeños grupos de células de un tejido heterogéneo de manera selectiva, eficiente y rápida; posibilitando el estudio sistemático de la calidad y cantidad de biomoléculas (ADN, ARN, o proteínas) en poblaciones específicas de células.

Para poner en marcha esta tecnología el Instituto adquirió un equipo de última generación para la microdisección láser (ArcturusXT, Life Technologies Applied Biosystems, USA), con un subsidio PME (Proyectos de Modernización de Equipamiento), otorgado por la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica. Se incorporó también un profesional altamente capacitado, de la Carrera de Personal de Apoyo del CONICET, Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, para manejar el equipo, asesorar sobre sus posibilidades y aconsejar sobre las estrategias a utilizar para garantizar un servicio de excelencia.

El servicio de microdisección láser (SML) del IBYME se encuentra enmarcado en un STAN (Servicio Tecnológico de Alto Nivel) de CONICET, y ofrece la posibilidad de realizar el proceso desde la tinción del tejido hasta el aislamiento de ARN total de las células de interés. El procedimiento que realizan los técnicos, asegura el mejor rendimiento de las muestras como resultado de la utilización de reactivos optimizados para la microdisección, de condiciones de trabajo libre de nucleasas, y de la mayor rapidez con que se realiza la técnica.

Este nuevo laboratorio no solo colaborará con los grupos de trabajo del IBYME, sino también con investigadores de otras instituciones tanto públicas como privadas que lo requieran.
El primer equipo de microdisección por captura láser, fue desarrollaron en 1996 por el Nacional Institute of Health (NIH), junto con Arcturus Engineering, hoy parte de Life Technologies. En Argentina solo hay 2 equipos de Microdisección Láser automatizados, y el que funciona en el IBYME es el único que brinda servicios en el área metropolitana de Buenos Aires. El equipo combina la captura activada por láser infrarrojo y corte mediante láser ultravioleta, características que dan gran versatilidad y le permiten adaptarse a las necesidades de diversas líneas de investigación.

Esta tecnología que originalmente fue desarrollada para el análisis molecular de tumores, hoy puede ser aplicada en una gran variedad de tejidos, y abre nuevas posibilidades en el estudio de las bases moleculares de numerosas enfermedades.

Con el orgullo de seguir trabajando para el adelanto de las ciencias básicas y aplicadas, compartimos esta nueva herramienta para la investigación y desarrollo en biomedicina.

La Técnica

La Microdisección por captura láser

El sistema de microdisección por captura láser (LCM, por sus siglas en inglés) ArcturusXT de Life Technologies está montado sobre un microscopio óptico invertido (Nikon Eclipse Ti-E) que permite observar el tejido y seleccionar las regiones de interés a través de una computadora. Una membrana termo fusible de 6mm de diámetro pegada a una pequeña pieza plástica llamada CapSure es el elemento que captura la muestra. El CapSure se coloca apoyado sobre el corte de tejido en la región de interés, luego un láser infrarrojo (IR) de baja energía funde la membrana específicamente sobre las células seleccionadas adhiriéndolas a la membrana. El láser ultravioleta (UV) puede ser utilizado para cortar el tejido y facilitar la captura o para eliminar tejido no deseado. El CapSure se levanta llevando consigo el tejido adherido a la membrana. Una vez terminada la microdisección se observa la eficiencia y se documenta fotografiando el resultado. El proceso se realiza en forma automatizada, controlado por computadora con la mínima intervención manual necesaria para abastecer al instrumento y retirar las muestras. Finalmente cada CapSure con el tejido capturado se encastra con un tubo de 0,5 ml conteniendo la solución de extracción para las moléculas de interés.

El Equipo

Sistema de Microdisección por Captura Láser ArcturusXT.

Instrumento automatizado para microdisección láser de muestras de tejido por corte (láser UV) y captura (láser IR).

El sistema se encuentra montado sobre un microscopio invertido Nikon Eclipse Ti-E de objetivos y platina motorizada con resolución de 1 µm . Cuenta con óptica de campo claro y contraste de fase y dos cámaras CCD color, una para operar el sistema en vivo y otra para fotografías de alta resolución. Próximamente se contará también con i luminación Epi-Fluorescente con cubos de filtros rojo, verde, azul y UV.

El equipo cuenta con 4 objetivos de aire y un lente 1,5x que aumenta la magnificación de cualquier objetivo en un 50%:

Mag.
NA
Objetivo Nikon
2x
0.06
Plan UW
10x

0.30

Plan Fluor Ph1 DL
40x
0.60
ELWD Plan Fluor Ph corr.
60x
0.70
ELWD Plan Fluor Ph corr.

 

El Servicio

En el servicio de microdisección láser (SML) del IBYME permite realizar el proceso desde la tinción del tejido hasta la aislación de ARN total de las células de interés, asegurando el mejor rendimiento de las muestras como resultado de la utilización de reactivos optimizados para microdisección, de una mayor rapidez en el procedimiento y de condiciones de trabajo libre de nucleasas.

Reconocimiento de las células de interés 
Reconocer en forma inequívoca las células de interés es un paso muy importante porque de eso depende la selectividad de la microdisección. Observar al microscopio y reconocer estructuras en cortes que no están embebidos en medio de montaje puede resultar una tarea compleja. En algunos casos con un poco de práctica es posible reconocer las células de interés sin necesidad de marcarlas, pero en otros es necesaria alguna tinción general o una marcación específica. La microdisección láser es compatible con métodos para marcar células selectivamente como inmunohistoquímica o hibridación in situ. Sin embargo los protocolos deben ser optimizados para minimizar el tiempo de exposición a soluciones acuosas y utilizar reactivos y materiales libres de nucleasas.

En el laboratorio se cuenta con dos tipos de tinción nuclear realizadas con reactivos Arcturus, uno para tejido congelado (Kit Histogene) y otro para tejido fijado y parafinado (Paradise Staining Kit). La coloración que dan es muy similar al Violeta de Cresilo. Estos reactivos son libres de nucleasas y proteasas y no interfieren con reacciones de RT-PCR que puedan realizarse a posteriori con el ARN aislado. La tinción se realiza en el momento previo a la microdisección

El módulo de fluorescencia con el que próximamente contará el equipo, permitirá identificar las células de interés, en aquellos tejidos que expresan una proteína fluorescente, o células marcadas por inmunofluorescencia con anticuerpos específicos.

La microdisección 
Existen cinco modalidades de microdisección por captura láser que permiten procesar una amplia variedad de tejidos y hasta células en cultivo. La microdisección estándar es el punto de partida cuando no hay una recomendación inicial diferente. Las cinco modalidades pueden ser utilizadas con tejido congelado, o fijado y embebido en parafina. Sin embargo se recomienda utilizar tejido congelado siempre que sea posible porque mantiene mejor la calidad y cantidad de biomoléculas.

El SML recibe los cortes de tejido ya montados en el portaobjetos que corresponda según la modalidad de microdisección.

Microdisección estándar en portaobjetos de vidrio:
Es la modalidad adecuada para estructuras multicelulares. Los cortes de tejido tienen que ser finos (3 a 15 µm) y deben estar deshidratados. Se montan en portaobjetos estándar sin adhesivos. Se realiza la microdisección utilizando CapSure tipo Macro y activando el láser IR. Cada CapSure Macro con el tejido capturado se encastra en un tubo de 0,5 ml con 50 µl de solución de extracción.

Microdisección de alta sensibilidad en portaobjetos de vidrio: 
Modalidad adecuada para capturar células únicas que se encuentran en poca cantidad. Se utilizan CapSure tipo HS que están diseñados para minimizar la posibilidad de contaminación con tejido no deseado y permite trabajar con menor volumen de solución de extracción. Los cortes de tejido tienen que ser finos (3 a 15 µm) y deben estar deshidratados. Se montan en portaobjetos estándar sin adhesivos. Cada CapSure HS con el tejido capturado se encastra con un adaptador (ExtractSure) donde se inicia la extracción en 10 µl de solución.

Microdisección estándar en portaobjeto con membrana de polietileno:
Modalidad recomendada cuando es necesario capturar áreas grandes de tejido o cuando se necesita mejorar la eficiencia de la microdisección en portaobjetos estándar. También permite trabajar con cortes de mayor espesor ya que el tejido está adherido a una membrana que se cortará con el láser UV. Los cortes de tejido pueden ser de 3 a 100 µm y deben estar deshidratados, se montan en portaobjetos con membrana de polietileno-naftaleno (PEN Membrane Slides). La microdisección se realiza utilizando los CapSure tipo Macro, activando el láser IR y el UV. Cada CapSure Macro con el tejido capturado se encastra en un tubo de 0,5 ml con 50 µl de solución de extracción.

Microdisección de alta sensibilidad en portaobjeto con membrana de polietileno:
Modalidad recomendada cuando se quieren capturar células únicas que no pueden ser levantadas de portaobjetos estándar y se requiere asegurar alta sensibilidad. Los cortes de tejido pueden ser de 3 a 100 µm y deben estar deshidratados. Aquí se combinan el uso de CapSure HS y portaobjetos con membrana de polietileno-naftaleno.

Microdisección en marco metálico con membrana de polietileno: 
Este tipo de microdisección es para cortes que no puedan ser deshidratados y para cultivos celulares que hayan sido crecidos en la membrana de polietileno-naftaleno. Los cortes de tejido deben estar montados en un marco metálico con membrana de polietileno-naftaleno (PEN Membrane Frame Slides). La membrana termo fusible del CapSure tipo Macro no entra en contacto con el tejido sino que se adhiere a la membrana de polietileno, que es cortada con el láser UV junto con el tejido seleccionado.

Aislación de ácido ribonucleico (ARN)
Este paso que requiere especial cuidado dado que el material del que se parte suele ser escaso. Por eso se utilizan kits basados en columnas de alta recuperación que permiten obtener ARN de alta calidad rápidamente después de la extracción.

En el laboratorio se cuenta con dos kits de Arcturus optimizados para muestras de microdisección, uno para muestras congeladas y otro para muestras fijadas. La aislación de ARN de muestras congeladas se realiza con el kit Arcturus PicoPure que está preparado para obtener ARN de tan poco como 10 células. Aislar ARN a partir de tejido fijado en formalina y embebido en parafina (FFPE) representa un desafío adicional porque este tratamiento produce cross-linking. Sin embargo en este caso es posible recuperar ARN de buena calidad utilizando el kit Arcturus Paradise que fue especialmente optimizado para este tipo de muestras.

La extracción debe comenzarse inmediatamente luego de la microdisección. El ARN celular total se entrega purificado en 10 a 50 µl de solución de baja fuerza iónica listo para ser utilizado en análisis posteriores de RT-PCR.

Imágenes

Inhibidores de acetilasas de histonas y células NK: una señal de alerta para su empleo en el tratamiento de enfermedades malignas.

CÉLULAS DE LA GRANULOSA

   
Microdisección por captura láser de células de la granulosa de folículos de ovario de rata.

MOTONEURONAS

     
Microdisección por captura con láser IR y corte con láser UV de motoneuronas del asta ventral de médula espinal de rata.

MÉDULA ESPINAL

       
Microdisección por captura con láser IR y corte con láser UV de áreas de sustancia gris y blanca de médula espinal de rata

Captura láser de células del Asta Dorsal

      
Microdisección por captura con láser IR y corte con láser UV de células de asta dorsal de médula espinal de rata.

Costos

Servicio de Microdisección Láser IBYME-CONICET

Servicio tecnológico de Alto Nivel (STAN) CONICET Nº 2019/11.

PRESTACIÓN INTERNOS EXTERNOS
Cortes de tejido congelado $280/h $350/h
Preparación de muestras $100/h $120/h
Microscopía de fluorescencia $60/h $80/h

Microdisección Láser ESTANDAR en portaobjetos de Vidrio
Microdisección Láser HS en portaobjetos de Vidrio
Microdisección Láser ESTANDAR en portaobjetos Membrana PEN
Microdisección Láser HS en portaobjetos Membrana PEN
Microdisección Láser en Marco Metálico con Membrana PEN

$ 350
$ 650
$ 600
$ 880
$ 630
$ 400
$ 750
$ 700
$ 1000
$ 720
Tinción de cortes fijados (Kit PARADISE stain, Arcturus)
Tinción de cortes congelados (Kit HISTOGENE, Arcturus)
$ 65
$ 30
$ 85
$ 40
Extracción de ARN de tejido fijado (Kit PARADISE, Arcturus)
Extracción de ARN de tejido congelado (Kit PICOPURE, Arcturus)
-
$ 500
-
$ 600

Ref: HS: High Specificity; PEN: Polyethylene Naphthalene

Tarifas vigentes a partir del 1 de mayo de 2017

Los precios son por unidad salvo en las casos especificados. Para las tinciones la unidad es cada corte coloreado, para la microdisección es cada CapSure y portaobjetos con membrana utilizado, y para la extracción de RNA es cada purificación realizada. Normalmente el tejido capturado en un CapSure se utiliza en una purificación.

El pago se puede realizar en la administración del IBYME en efectivo o por transferencia bancaria. Para los usuarios internos se puede hacer una liquidación mensual a través de la administración.

Contacto

CONTACTO:
Dr. Pablo E. Pomata
Servicio de Microdisección Láser - IBYME-CONICET
Vuelta de Obligado 2490 (1428) CABA
Tel:(11) 4783-2869 int. 317
Fax:(11) 4783-2564
E-mail: microdiseccion@ibyme.org.ar

Laboratorios
BOOM |