Mecanismos Moleculares de la Fertilización

1) Mecanismos moleculares involucrados en el proceso de fertilización

Los mecanismos moleculares involucrados en el proceso de fertilización han sido extensamente estudiados en las últimas décadas. Sin embargo, la información obtenida hasta el momento es aún muy limitada. Nuestros resultados indican que los cuatro miembros de la familia CRISP1-4 (Cysteine RIch Secretory Protein), mayoritariamente presentes en el tracto reproductivo y altamente conservadas a lo largo de la evolución (desde plantas hasta el humano), cumplen importantes roles en diferentes etapas del proceso de fertilización a través de su capacidad de regular canales de calcio. En ese sentido, nuestros resultados indican que CRISP1 regula el principal canal de calcio del espermatozoide denominado CatSper. Si bien los animales knockout para cada una de las proteínas resultaron fértiles, la generación de colonias dobles KO permitió  confirmar que las CRISP no solo participan en el proceso de fertilización sino que son relevantes para la fertilidad de un individuo, apoyando la existencia de una cooperación funcional entre proteínas CRISP homólogas con el fin de asegurar el éxito reproductivo.  Asimismo, a través de la técnica de CRISPR-Cas9, hemos generado animales dobles KO para las proteínas CRISP1 y  CRISP3 que resultaron subfértiles como así también animales triples KO carentes de CRISP1, CRISP2 y CRISP3 y cuádruples KO carentes de todas las proteínas de la familia, los cuales fueron infértiles por exhibir una combinación de defectos a nivel de la migración de los espermatozoides por el tracto femenino, en la interacción de gametas, y en el desarrollo embrionario. Por otro lado, estos estudios evidenciaron la existencia de módulos funcionales tales como el módulo epididimario CRISP1/CRISP4 involucrado en la maduración e interacción de gametas, el módulo testicular CRISP2, requerido par la adquisición de flexibilidad de la pieza media del la cola, y el módulo seminal CRISP1/CRISP3 involucrado en la motilidad de los espermatozoides en el útero y oviducto. Más allá de las múltiples funciones en reproducción, evidencias de nuestro grupo indican que las proteínas CRISP también actuarían como reguladores del sistema inmune y se expresan en células dendríticas, pudiendo estar involucradas en el desarrollo de enfermedades con componentes inmunológicos tales como el cáncer y enfermedades autoinmunes. Estos resultados, junto a la existencia de homólogos funcionales a las CRISP en el epidídimo y espermatozoides humanos, indican la relevancia de nuestras observaciones para el estudio de la fertilidad/infertilidad humana. 

2) Potencial uso de proteínas del espermatozoide para el desarrollo de métodos de regulación de la fertilidad.

La primera evidencia acerca de la relevancia de las proteínas CRISP para la fertilidad fue dada por resultados de nuestro grupo mostrando que la inmunización de ratas con CRISP1 es capaz de producir una respuesta inmune específica y una disminución significativa y reversible de la fertilidad en ambos sexos. Estos resultados en roedores fueron apoyados por estudios de inmunización utilizando la proteína CRISP1 humana en un modelo de primates no humanos y, conjuntamente con nuestros recientes estudios utilizando animales KO, apoyan fuertemente el empleo de las proteínas CRISP tanto para el tratamiento de la infertilidad masculina, como para el desarrollo de nuevos métodos de regulación de la fertilidad. Por esta razón, nuestras investigaciones han contado con el apoyo de la Organización Mundial de la Salud (OMS) durante los últimos 30 años. Actualmente, nos encontramos trabajando en la identificación de las proteínas CRISP en caninos con el fin de desarrollar una vacuna anticonceptiva en esta especie. Finalmente, en colaboración con grupos de la FCEyN (UBA) y del IBIOBA-CONICET y el apoyo de MCI (Male Contraception Initiative), iniciamos un proyecto destinado a desarrollar un ensayo eficiente para el screening de numerosos compuestos con el objetivo de identificar compuestos (moléculas pequeñas) capaces de interferir con el rol de las CRISP en el proceso de fertilización,  de modo tal que los mismos puedan ser empleados en el futuro como método  anticonceptivo.

3) Interacción entre el sistema inmune y el tracto reproductor

Recientemente, hemos iniciado una línea de investigación a cargo de la Dra Mariana Wegel Muñoz, con el fin de caracterizar el perfil inmunológico del fluido y  epitelio epididimario utilizando como modelo una colonia de animales doble KO para dos proteínas abundantemente expresadas en el epidídimo tales como CRISP1 y CRISP4. Estos animales exhiben un cuadro de epididimo-orquitis espontánea que nos permite estudiar la participación de las proteínas CRISP en la modulación de la tolerancia inmune del epidídimo. Por otra parte, dado que es sabido que el microambiente inmunológico generado en el tracto femenino luego de la cópula influye en el éxito de la implantación embrionaria, nos encontramos estudiando los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta inmune uterina e implantación embrionaria utilizando como modelo diversas colonias de animales KO para las proteínas CRISP dada la abundancia de las mismas en el plasma seminal y su vínculo con el sistema inmune.

4) Estudio de las cascadas de señales y canales durante la capacitación del espermatozoide

Desde hace años, nuestro laboratorio tiene como objetivo esclarecer las cascadas de señales involucradas en el proceso de capacitación del espermatozoide utilizando el modelo murino y humano. En los últimos años encontramos que las quinasas PYK2 y Fer T actuaría regulando la entrada de Ca2+ al espermatozoide a través de la modulación del pH intracelular el cual impacta sobre la funcionalidad de CatSper, el principal canal de Ca2+ del espermatozoide. Actualmente, nos encontramos estudiando el rol de CatSper como así también del canal de potasio Slo3 en el proceso de capacitación y fertilización a través del empleo de animales KO para cada uno de estos canales,  

5) Mecanismos de activación del ovocito

Actualmente, nuestro laboratorio está involucrado en otra línea de trabajo a cargo de la Dra. Débora Cohen en la que estudiamos los mecanismos involucrados en la activación del ovocito que ocurre luego de la entrada del espermatozoide fertilizante. Ha sido claramente establecido que los eventos celulares asociados a la activación del ovocito requieren del aumento intracelular de calcio en forma de oscilaciones transientes inducidas por el espermatozoide fertilizante y que dan inicio a los eventos asociados al desarrollo embrionario. Asimismo, se ha podido reproducir la activación ovocitaria con otros agentes que inducen un aumento de calcio diferente al producido por el espermatozoide. Estas técnicas de activación artificial están siendo utilizadas en la práctica clínica con el reporte de recién nacidos vivos, pero sin suficiente respaldo teórico sobre su mecanismo de acción y seguridad para la progenie generada. En función de esto, nuestro objetivo es estudiar si las alteraciones en el patrón de calcio inducidas por la activación artificial de ovocitos con ionóforo de calcio producen modificaciones en los eventos celulares que ocurren río abajo de dicho aumento y que regulan el correcto inicio del desarrollo embrionario.

6)  Acetato de Ulipristal como anticonceptivo de emergencia.

En colaboración con otros grupos a nivel nacional e internacional, nuestro laboratorio se encuentra estudiando los mecanismos involucrados en el efecto anticonceptivo del Acetato de Ulipristral (UPA) en modelos de roedor y humano. Los resultados de esta línea, a cargo de la Dra. Cohen, permiten descartar efectos de UPA sobre la función espermática, la interacción de gametas y sobre la implantación en murinos. Actualmente, nos encontramos estudiando los efectos de UPA sobre la expresión génica del útero humano.

7) Metabolismo energético y fertilidad

La incidencia de trastornos metabólicos en la población aumentó de forma alarmante en los últimos años. En este sentido, el síndrome metabólico (SM), conjunto de desórdenes patofisiológicos que comprenden el aumento de al menos 3 de los siguientes factores: obesidad abdominal, presión arterial, triglicéridos, colesterol o glucosa en sangre, emerge como una novedosa área de investigación dentro del campo de la reproducción. Es por esto que hemos iniciado una línea de investigación a cargo de las Dras. Da Ros y Cohen, enfocada a estudiar los efectos del SM sobre la fertilidad masculina con el fin de comprender la fisiopatología subyacente al SM y estudiar posibles tratamientos. Para ello, se emplean como modelo ratones con SM. Los resultados obtenidos hasta el momento nos permiten proponer que los efectos reproductivos, que son diversos y no robustos, observados entre los machos con SM, podrían depender de factores adicionales no asociados con la condición metabólica y contribuidos no solo por el hombre afectado sino también por su pareja. 

Asimismo, y como otra mirada sobre la relación entre metabolismo y fertilidad masculina, hemos comenzado a estudiar la relevancia de la funcionalidad mitocondrial para la capacidad fertilizante del espermatozoide, utilizando el ratón como modelo. En este sentido, existen controversias acerca del rol de la glucólisis y de la OXPHOS para la adquisición de la capacidad fertilizante de los espermatozoides, no sólo en las diferentes especies estudiadas sino incluso dentro de una misma especie. Nuestra hipótesis de trabajo es que los espermatozoides poseen plasticidad metabólica para generar ATP, la cual es necesaria para la adquisición de la capacidad fertilizante, en respuesta a los cambios del tracto reproductor femenino durante las distintas etapas de la fertilización. Más aún, esta plasticidad metabólica podría ser determinante para el fitness de los espermatozoides, siendo los que mejor se adapten metabólicamente al entorno los que puedan llegar a fertilizar al ovocito.